Clonage

Nous souhaitons cloner le gène codant pour la protéine STAT5B sur un vecteur plasmidique afin d’exprimer la protéine en cellules de mammifère. Les phases d’un clonage moléculaire peuvent être résumées à 4 :

  • Préparation du fragment à cloner (amplification) : On prépare le fragment d’ADN à cloner et intégrer sur le plasmide
  • Digestion : On digère le plasmide et le fragment avec les mêmes enzymes pour que leurs extrémités soient complémentaires
  • Ligation : on utilise une enzyme ligase pour lier les extrémités complémentaires afin d’intégrer le fragment dans le plasmide
  • Intégration dans un organisme vivant : on intègre le plasmide dans un organisme vivant pour exprimer la protéine.

Le vecteur que nous allons utiliser est le pcDNA3

Figure 1 : Carte du pcDNA3

Préparation du fragment à cloner

Le premier pas pour préparer le fragment est, évidemment, d’avoir un fragment. Il faudra donc obtenir un brin matrice qui servira à la préparation pour son amplification ultérieure par PCR.

Obtention de la matrice :

Chaque type cellulaire exprime seulement un sous-ensemble de ses chromosomes. Pour la synthèse d’ADNc, on s’intéressera donc aux cellules exprimant le gène d’intérêt : si on obtient l’ARNm d’une source exprimant le gène d’intérêt, il y aura plus de possibilités d’identifier ce gène. Par conséquent il faut avant tout choisir un type cellulaire pour extraire l’ARN.

choix du type cellulaire La protéine STAT5B appartient à une famille de facteurs de transcription s’activant après avoir suivi une phosphorylation. Elle est impliquée dans de nombreux cancers de la lignée hématopoïétique. Pour la stratégie de clonage, nous allons donc récupérer les ARNm à partir des lymphocytes B.

Lyse et extraction de la totalité des ARN et purification des ARNm. L’ARNm est purifié à partir des cellules par chromatographie d’affinité -oligo(dT). Les molécules d’ARNm se couplent via leurs queues polyA avec l’oligo(dT) qui est fixé sur une colonne de cellulose, les autres ARN flottent dans la solution. Les couplés ARNm-oligo(dT) sont alors élués de la colonne et on peut donc purifier l’ARNm pour synthétiser l’ADNc.

Synthèse de l’ADNc.

À partir de l’ARNm purifié on peut alors synthétiser l’ADNc grâce à la Reverse Transcriptase (RT)

Amplification (PCR) préparation des amorces choix des enzymes

On pourrait utiliser une seule enzyme, mais cela entraînerait la création de recombinants dans les deux sens. On préfère orienter le fragment donc nous allons utiliser deux enzymes. Pour ce faire, il faut respecter la position 5’ATG - CDS - STOP 3’ et orienter le fragment. Les enzymes à choisir devront être absentes de la séquence codante à fin de ne pas la couper.

Enzymes dans le plasmide

Figure : Enzymes dans le plasmide

Enzymes dans le plasmide et absentes dans la séquence STAT5B

Figure : Enzymes dans le plasmide et absentes dans la séquence codante

Enzymes choisies ER1 : HindIII. Séquence : AAGCTT ER2 : EcoRI. Séquence : GAATTC

amorces Amorce 1

Figure : amorce 1

L’amorce doit avoir 18pb minimum pour assurer sa spécificité. 5’ ATGGCTGTGTGGATACAA 3’ Tm = 4(G+C) + 2(A+T) Tm = 4x8+2x10= 56 °C Nous souhaitons faire un clonage orienté (5’ ATG …. STOP 3’), donc il faudra que l’enzyme clivant côté promoteur dans le plasmide soit la même qui clive le fragment PCR à son extrémité 5’. L’amorce 1 doit contenir donc la séquence de l’enzyme choisie (dans l’occurrence Hind III) 5’ AAGCTT + ATGGCTGTGTGGATACAA 3’

Amorce 2 L’amorce 2 corresponde à l’inverse complémentaire des derniers 18 Pb (minimum)

Figure : amorce 2

5’ GGAATCGCACAATCGTGA 3’ 3’ CCTTAGCGTGTTAGCACT 5’ Avec le site de restriction d’EcoRI : 5’ GAATTC + TCACGATTGTGCGATTCC 3’ Tm = 4(4+5)+2(6+3) Tm = 36 + 18 = 54 °C

Aspects concrets de la PCR Dans notre tube Eppendorf, on doit retrouver : Amorces 1 et 2 dNTP matrice (cDNA) Taq pol Tampons (MgO2, tris) dénaturation Dénaturation à 95 ° à ~2 minutes hybridation Hybridation à 52 ° (Tm plus petit - 2 °C) élongation La Taq polymérase travaille idéalement à 72 °C. Il faut environ 1 minute pour synthétiser un fragment de 1 kb. Pour l’extension finale, 2 minutes à 72 °C. Temps d’extension : 1000pb —————- 1 min Taille du fragment —- Xmin X = Taille du fragment/1000 Pb

Figure : Taille du fragment ? Figure : Taille du fragment 2

Taille du fragment codant : 2354 - 180 = 2174 Taille du fragment PCR : 2174 + 12 Temps d’extension : 2186 -60/1000 = 131 s

cyclisation

On répète les étapes à la même température. La dénaturation pendant la cyclisation doit être faite à environ 30 s Généralement la cyclisation se fait entre 20 et 30 fois. Pour cette stratégie de clonage, nous allons fixer les cycles à 30 pour assurer qu’il y aura suffisamment des fragments pour les manipulations suivantes.

contrôle

Figure : Contrôle de la PCR Témoin de PCR (pas de matrice) amorces 1,2 dNTP Taq polymérase Tampon

Digestion Une fois nous avons préparé l’ADN à cloner et choisi le plasmide (pcDNA3) et les enzymes de restriction, on procédé à digérer l’ADN (fragment PCR et plasmide) avec les enzymes de restriction. Dans l’idéal, le fragment d’ADN et le plasmide devraient être digérés en parallèle pour économiser du temps. Pour digérer, on prépare 2 tubes Eppendorf : un servant à digérer le fragment PCR et l’autre servant à digérer le plasmide. On rajoute pour chaque tube notre ADN et ensuite un tampon de restriction pour assurer le bon fonctionnement des enzymes. Après avoir mélangé la solution, on rajoute les enzymes de restriction tout en incubant la réaction à la température idéale (normalement 37 °C, mais peut varier en fonction des enzymes de restriction) On laisse « tourner » la réaction pendant 40-60 minutes puis on dephosphoryle le vecteur à l’aide de la phosphatase pour éviter sa recircularisation.

Contrôle On fait migrer les fragments digérés dans un gel d’agarose. Figure : Contrôle

3 possibilités : La digestion n’a pas du tout marché. Dans ce cas-là il faut vérifier si les enzymes de restriction sont fonctionnelles. Et tout recommencer. La réaction a marché, mais le vecteur n’est que partiellement coupé après 40 minutes de réaction (ceci est indiqué par une présence de plus d’une bande d’un poids moléculaire similaire à celui attendu pour notre vecteur). On pourrait estimer à ce moment-là combien de temps de temps prendra la digestion et en refaire une nouvelle. La digestion est complète. Nous avons un plasmide/fragment à cloner prêt pour l’étape suivante (ligation)

Ligation. La digestion des l’ADN ayant été faite et contrôlé, on peut passer à la ligation. Nous pouvons donc à présent utiliser l’ADN ligase pour lier les extrémités complémentaires des échantillons d’ADN. Après traitement avec la ligase, on devrait retrouver dans notre échantillon : - Des plasmides digérés - Des fragments digérés - Des plasmides recircularisés sans l’insert (si la déphoshorilation n’a pas marché) - Des plasmides recombinants L’étape suivante consistera à transformer nos E.Coli avec cet échantillon pour contrôler la ligation puis sélectionner les bons clones.

Transformation bactérienne Généralement, on transforme les plasmides recombinants sur des E.coli à cause de sa grande capacité de transformation et de sa simplicité de manipulation ce qui permet d’obtenir beaucoup de colonies. Pendant la transformation chaque bactérie ne devrait prendre qu’une molécule d’ADN. Cette molécule sera alors amplifié dans la cellule ce qui permettra d’obtenir des colonies ayant qu’un type de plasmide, ainsi cela permet de récupérer et d’isoler les colonies ayant le gène d’intérêt. Pour accomplir cette phase, il faut d’abord rendre E.Coli compétente. Plusieurs choix s’offrent à nous, les plus communs sont le traitement par CaCl2 et l’éléctroporation. Dans cet exercice nous utiliserons l’éléctroporation, méthode consistant à induire la rentrée d’ADN en provoquant un changement de tension pour créer des pores dans la membrane qui laisseront passer des molécules, dans l’occurrence, les plasmides (recombinés ou pas). Ensuite, on mélange les échantillons d’E.Coli déjà compétentes avec l’ADN. Le réarrangement membranaire permet donc le passage du plasmide à travers la membrane et lorsque les impulsions sont arrêtées, la bicouche se répare elle-même, ce qui permet l’intégration du plasmide. On pourra alors contrôler les bactéries ayant acquis le plasmide sur des boîtes Petri traitées avec un antibiotique spécifique. Le plasmide utilisé contient un gène de résistance aux antibiotiques. Les bactéries ayant acquis le plasmide (avec ou sans insert) seront à l’origine des colonnes, tandis que celles ne l’ayant pas intégré mourront.

Contrôle Pour cette phase on devrait trouver des colonies dans l’ordre de 5*10. Si c’est le 6 cas, on peut choisir des colonies sur chaque boîte au hasard et récupérer l’ADN plasmidique qui sera alors digéré avec les enzymes de restriction choisis précédemment pour vérifier la présence des inserts (électrophorèse) D’un autre côté, toutes les étapes précédentes entraînent des produits non souhaités (plasmides non digérés, plasmides recirularisés, bactéries ayant acquis l’un où l’autre, mais pas le plasmide recombiné…) Il faut donc contrôler ces cas.

C1 : Plasmide non digéré : Témoin : vecteur tout seul, sans ligase. Si on obtient des colonies avec ce contrôle, alors la digestion par restriction du vecteur n’a pas fonctionné parce qu’on obtient des colonies même sans ligase.

C2 : Plasmide incorrectement déphosphrylé : Témoin : Vecteur + ligase sans fragment. Si on obtient des colonies avec ce contrôle, mais pas avec le c1, alors le traitement avec la phosphatase n’a pas marché. Cela montre que la digestion a marché (pas de colonies en 1), mais la ligase a quand même réussi a recirculariser le plasmide parce que les 5-Phosphates n’on pas été élimines pendant la dephosphor.

Plasmide recombinant : Si on obtient des colonies dans 3 (ou en peu moins) en 1 et en 2 alors la ligation a marché et on peut faire la sélection à partir de là.

Sélection figure : selection

  1. On fait une culture sur la nuit à 37 ° C + antibiotique à partir de plusieurs colonies.
  2. On extrait et purifie l’ADN plasmidique.
  3. On fait une digestion par les enzymes de restriction choisies au début de l’exercice.

Figure : digestion vecteur.

  1. On fait une électrophorèse sur un gel d’agarose + BET

  2. On observe les bandes pour déterminer quels échantillons contiennent les plasmides recombinants (dans la figure 1,3 et 4)

figure : bandes sélection Éphèse

Intégration La transfection est le processus pour lequel les acides nucléiques sont introduits dans les cellules de mammifère. Dans cet exercice on cherche a faire de la transfection transitoire, une transfection où l’acide nucléique existe dans la cellule pour une période limitée de temps (donc pas d’intégration génomique). Le plasmide n’ayant pas d’origine de réplication eucaryote, il sera exprimé transitoirement de facto puisque le matériel transfecté n’est pas transmis aux cellules filles lors de la mitose. Le plasmide sera donc dilué avec les successives divisions cellulaires. D’un autre côté le grand nombre de copies du matériel transfecté conduisent à des niveaux d’expression élevés pendant la période de temps où le matériel existe dans la cellule ce qui facilité le contrôle de l’expression. En fonction de la construction utilisée, le matériel transfecté peut être détecté généralement entre 1 et 7 jours.

Culture Ku812 Certaines protéines nécessitent des modifications post-transcriptionnelles spécifiques à certains types cellulaires, par conséquent, si on essaie d’exprimer ces protéines sur des types cellulaires différents à ceux, les protéines résultantes 12 Seront inactives. On doit donc choisir correctement la lignée cellulaire pour exprimer la protéine. Pour l’exercice on nous donne déjà la lignée à utiliser, des cellules Ku812 issues de la lignée hématopoïétique.

Transfection eucaryote Il y a plusieurs méthodes permettant de transfecter sur des cellules de mammifère. Pour l’exo nous avons choisi l’éléctroporation, technique décrite précédemment. Après transfection par éléctroporation on doit sélectionner les cellules qui ont acquis l’ADN. Le pcDNA3 contient une région « néo » qui code pour la résistance à la néomycine.

Contrôle de la transfection : Les cellules de mammifère ayant acquis le plasmide pousseront sur des milieux contenant de la néomycine, tandis que les cellules ne l’ayant pas acquis mourront. Contrôle de l’expression On utilisera du Western blotting pour détecter l’expression de la protéine. La totalité des extraits protéiques est obtenue à partir d’une cellule transfectée. Les protéines seront alors séparées par électrophorèse. Les protéines du gel sont transférées sur une membrane et sondées avec des anticorps spécifiques. On peut ainsi détecter la présence de la protéine en fonction de la taille attendue (environ 93 kDa pour STAT5B). Si la protéine est détectée, on peut alors contrôler l’activité biologique Contrôle de l’activité biologique (Expression transitoire) Les cellules ayant acquis le plasmide lysent au bout de quelques jours (conséquence du haut degré d’ADN dans la cellule) donc la protéine est exprimé pendant quelques jours et donc de façon transitoire.

20200502152452 w

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