Exámenes y ejercicios de biología celular

Exámen del 2019-2020

  1. 20200619162138 Séquences répétées
  2. 20200619162248 Cycle Cellulaire et Développement — 20 minutes
  3. 20200619162220 Analyse de documents (Epignétique -F. Friocurt -1h30)
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Séquences répétées

Pour chaque type de séquences répétées vues en cours, indiquez en quelques phrases et schémas:

  • Leur nom
  • Leur structure
  • Leur(s) fonctions principale(s)
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Inhibiteur

Vous choisiriez un inhibiteur des complexes cycline-cdk vu en cours et vous dcrirez son rôle.

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Analyse de documents

Exercises réalisés avec les données de l’article d’Agger et al., Nature 2007, UTX and JMD3 are histone H3K27 demethylases involved in HOX gene regulation and developpmenet.

On s’intéresse ici à la protéine UTX. Le gène Ubiquitously transcribed Tetratricopeptide repeat X (UTX), qui code pour cette protéine, est situé sur le chromosome X chez l’homme mais échappe à l’inactivation du X. Cette protéine est fortement expriméee, en particulier dans les cellules souches embryonnaires. La structure de cette protéine est représentéé sur la figure 1.

  1. D’après les domaines identifiés sur la Figure 1, proposez une fonction por la protéine UTX.

UTX

Figure 1: Structure de la protéine UTX avec ses domaines TP (tetratricopeptide repeat) et JjmJC. La protéine de fusion HA-UTX est présentée en dessous avec son groupement supplémentaire hemagglutinin (HA) N-terminal

Pour tester l’activité de UTX, les chercheurs mettent au point un shRNA contre UTX (shUTX1). Ils expriment le shRNA dans des cellules HeLa en culture et observent la présence de différents marqueurs par western-blot (Figure 2)

Figure 2

Figure 2: Immunomarquage des cellules HeLa transfectées un shRNA contre UTX (shUTX1) ou shRNA d’une séquence aléatoire (shScr). Les plasmides exprimant les shRNA expriment également la protéine GFP. Les anticorps utilisés sont : anti-GFP (vert) ; anti-UTX; anti-H3K27me3; ou anti-H3K9me3 (rouge). L’agent intercallant DAPI permet de marquer les noyaux (bleu). Les flèches indiquent les positions identiques sur les trois couleurs d’une même expérience (horizontale)

  1. Expliquez en trois phrases le principe de l’utilisation des shRNA.

  2. Analysez les résultats obtenus dans la fiure 2 (ANNEXE couleur). Quels sont les diffrentes contrôles utiliss dans cette expérience? Les chercheurs décident ensuite de tester l’activité d’UTX in vitro. Pour cela ils incubent des histones purifiées avec des concentrations croissantes d’UTX et analysent les résultats par western-blot.

  3. Rappelez brièvement le principe du Western blot.

  4. Analysez le document 3 sans oublier les contrôles. Quelles informations supplémentaires vous apporte cette expérience.

Figure 3 Figure 3: Western-Blot réalisés à partir des préparations d’Histones incubées avec des quantités croissantes de protéine UTX. Les anticorps utilisés sont indiqués à droite. La dernière ligne correspond au marquage au bleu de Coomassie des Histones utilisés dans l’expérience.

A partir de ces données, les chercheurs se sont intéressés au rôle de cette protéine in vivo. Pour cela ils ont analysé l’expression d’un gène du développemnt HOXB1 dans les cultures de cellules.

  1. Analysez pas à pas les différentes parties de la figure 4. Vous expliciterez l’objectif de l’expérience, les techniques utilisées avec leurs côntroles et les résultats obtenus.

Figure 4 Figure 4: Etude de l’effet d’UTX sur l’expression de HOXB1. a. Schéma du Locus de HOXB1 avec son site d’initiation (TSS). Les flêches rouges indiquent la localisation des amorces utilisées pour le Chip en (c). b. Mesure de la variation d’ARNm HOXB1 24h après traitement (+) ou non (-) avec de l’acide rétinoïque (RA). Cette mesure est réalisée par PCR quantitative. c. Résultats d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivi d’aplification par les amorces de PCR indiquées en (a). Ces expériences sont réalisées sur des cellules en culture 24h après traitement au RA (+) ou sans traitement (-). Les anticorps utilisée pour la ChIP sont indiqués sous chaque graphique: antHA; anti-UTX; anti-H3K27me3; anti-EZH2; anti-H3K4me3

  1. À l’aide de votre cours, et sachant qu’Ezh2 fait partie du complexe PRC2, comment expliquez vous les résultats obetenus dans la figure 4c?

Pour aller plus loin, les scientifiques réalisent des expériences similaires mais en traitant les cellules avec des shRNA anti-UTX

Figure 5

Figure 5: Etude de l’effet des shUTX sur l’expression de HOXB1 a. Mesure de l’expression d’UTX par qPCR dans des cellules transfectées avec des shARN aléatoire (shScr) ou antUTX (shUTX; shUTXé). La qPCR est réalisée 24h après traitement ou non au RA. b. Mesure de la variation d’ARNm HOXB1 dans des celules transfectées avec shScr, shUTX1 ou shUTX2, 24h après traitement ou non au RA. Cette mesure est réalisée par qPCR. c. Résultats de ChIP suivi d’amplification par les amorces de PCR de la figure 5a. Ces expériences sont réalisées sur des cellules transfectées avec shScr ou shUTX1. Les anticorps utilisés pour la ChIP sont indiqués sous chaque graphique: antHA; anti-H3K27me3; anti-H3.

  1. Analysez la figure 5 en explicitant les techniques et contrôles utilisés.
  2. Proposez une synthèse de ces résultats sur le rôle d’UTX sur l’expression de HOXB1. Vous présenterez cette synthèse sous forme d’un schéma incluant les différentes acteurs vus dans les documents.
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